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關於PCR如何改進qPCR資料

釋出時間☁•◕│₪:2022-07-22   點選次數☁•◕│₪:229次

關於實時熒光定量PCR技術✘•·╃•,最常見的應用是透過RT-qPCR進行基因表達分析·☁、疾病診斷和管理(如病毒定量)·☁、食品檢測(如轉基因或過敏原分析)以及動物或植物育種等研究☁₪╃·。這種方法非常靈敏✘•·╃•,因此為了得到可靠的實驗資料✘•·╃•,避免錯誤是十分重要的☁₪╃·。RT和qPCR資料評估的整個工作流程包括以下幾點☁•◕│₪:

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1·☁、實驗設計
2·☁、樣品的製備和提取/純化
3·☁、RT和qPCR
4·☁、資料評估
在以上過程中✘•·╃•,實驗人員有可能因為操作錯誤或失誤導致實驗資料的失真☁₪╃·。但往往有些錯誤的來源又十分不明確✘•·╃•,所以排除故障的第一步是需要再次檢查實驗流程並重復實驗☁₪╃·。

實驗設計
RT或qPCR反應的第一個重要步驟是測定PCR產物及驗證相應的引物和探針☁₪╃·。實時RT-qPCR引物和探針最/有效的設計是使用引物設計軟體✘•·╃•,大多數軟體都可以調整設定引數的屬性✘•·╃•,以檢索到符合要求的引物探針序列☁₪╃·。這些設定引數考慮熔化溫度Tm·☁、互補性·☁、二級結構以及擴增子大小和其他重要因素☁₪╃·。同時建議跨內含子設計引物✘•·╃•,避免來自gDNA的干擾✘•·╃•,直接得到cDNA片段☁₪╃·。對於基因特異性引物的設計✘•·╃•,應滿足以下標準☁•◕│₪:

擴增子大小: 75-200 bp
引物長度: 18-30 bp
GC 含量: 40-60%
解鏈溫度: 55-60℃
3' 端: 1-2 G or C✘•·╃•,以具有良好的穩定性
不超過3個G or C (可能不匹配)
沒有二級結構✘•·╃•,重複序列或迴文結構
濃度: 150-200 nM

樣品的製備和提取/純化
模板的質量直接影響到檢測效能✘•·╃•,在qPCR結果的故障排除過程中也需要考慮☁₪╃·。首先✘•·╃•,組織取樣和儲存是實驗可變性的第一個潛在來源☁₪╃·。對於基因的定量✘•·╃•,必須使用高質量的RNA✘•·╃•,這意味著需要非常仔細地檢查RNA的濃度和質量☁₪╃·。

降解或不純的RNA會限制逆轉錄反應的效率✘•·╃•,降低產量;部分降解的RNA可能不能給出準確的基因表達結果☁₪╃·。核酸應從新鮮或立即冷凍的組織中提取和純化;同時建議使用生物學重複(至少3個)☁₪╃·。RNA或DNA的分離是PCR實驗前的關鍵步驟☁₪╃·。這是必要的✘•·╃•,以便提取對所有樣本都是有效的✘•·╃•,並得到純化的核酸(DNA✘•·╃•,RNA)☁₪╃·。可採用高解析度瓊脂糖凝膠檢測核酸質量和分光光度法(A260/A280=1.8和A260/A230=2.0)檢測核酸純度☁₪╃·。

另外也要注意✘•·╃•,用於PCR製備的工作空間所有檯面及物品都應進行常規去汙✘•·╃•,以防止交叉汙染☁₪╃·。

逆轉錄和實時熒光定量PCR

RT-qPCR是一種分析DNA或RNA的高靈敏性工具☁₪╃·。當PCR擴增靶標時✘•·╃•,錯誤同時被放大☁₪╃·。可以透過標準化和儘量減少移液步驟來減少PCR反應中的技術錯誤;在無灰塵的乾淨環境中建立反應;透過對無模板(水)對照進行PCR反應✘•·╃•,常規檢查引物和試劑庫存的DNA汙染等☁₪╃·。

在進行qPCR時可能會出現以下故障☁•◕│₪:沒有擴增·☁、qPCR效率多大或過小·☁、Cq值過大·☁、重複性差·☁、擴增曲線異常·☁、非特異性擴增等等☁₪╃·。

執行後的資料分析-基線和閾值的設定

基線校正是去除背景熒光的必要條件☁₪╃·。可能的原因是qPCR裝置的檢測器噪音✘•·╃•,或是不同的樣品量或染料(探針或插入染料)的殘留熒光☁₪╃·。所有樣本的基線起點一般從0~3個迴圈開始進行量化✘•·╃•,基線終點是在各個擴增曲線起峰位置前的1~2個迴圈☁₪╃·。為了使實時RT-qPCR資料有意義✘•·╃•,應在擴增曲線的指數擴增階段設定閾值✘•·╃•,閾值自動設定一般是基線期熒光訊號標準偏差的10倍☁₪╃·。


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